建立了高效液相色谱法快速准确定量微量植物体中重要植物色素(叶绿素a、高效叶绿素b和叶黄素)的液相分析方法。微量植物叶片以95%乙醇匀浆超声提取色素4 h,色谱素过滤膜后直接分析。法准色谱分离选用COSMOSIL氰基柱(4.6 mm × 250 mm,确定5 μm),量微量植以甲醇-水洗脱进行洗脱,物体物色流速为1.0 mL/min,中的重植用二极管阵列检测器检测,高效可在15 min内完全植物中三种重要色素的液相快速分离分析。结果表明,色谱素三种色素在0.05~50 mg/L范围内线性关系良好(相关系数均为0.9999);平均加标回收率为90%~110%;相对标准偏差(RSD)<5%;日内及日间精密度均<5%,法准满足定量要求。确定与目前检测植物色素的量微量植方法相比,该方法前处理简单快速,物体物色且采用简单的甲醇-水体系快速分离植物色素,结果可靠,重现性好,可为植物体的生理研究提供基础。 目前,测定植物色素的常用方法紫外分光光度法、荧光分析法、活体叶绿素仪法、光声光谱法和高效液相色谱法等。高效液相-质谱联用技术有着高压、高速、以及高灵敏度的优点。该方法经液相色谱分离,比现有的紫外分光光度法具有更低的干扰及检出限;与荧光分析法相比,二极管阵列检测器更为普及。利用液相色谱定量检测植物色素含量准确率高。这3种色素结构相似、性质相近,有必要发展一种能够很好地分离3种色素且能准确定量的色谱方法。选择能获得对称峰形的色谱柱、合适的流动相以及合适的流动相比例对于植物体中叶绿素a、叶绿素b以及叶黄素的色谱分离分析十分重要。 本文使用键合氰基的氰基色谱柱,以简单的甲醇和超纯水为流动相,建立一种快速定量分析植物体中叶绿素a、叶绿素b以及叶黄素含量的反相高效液相色谱法,极大地提高了植物体中该3种重要色素含量准确测定的可靠性和速度,为研究植物体的生理特性提供了基础。 1 实验部分 1.1 主要仪器与试剂 Shimadzu LCMS-2020型液相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司);COSMOSIL型氰基柱(日本半井公司);FLUKO F6/10-8G型超细匀浆机(上海弗鲁克流体机械制造有限公司);Heraeus型高速低温离心机(韩国贺利氏公司);百万分之一、十万分之一OHAUS型电子分析天平(美国奥豪斯公司);Millipore Simplicity型超纯水系统(美国Merck公司)。 无水乙醇、0.45 μm过滤头、新鲜绿色植物叶片、甲醇(德国CNW公司)、叶绿素a标准品(99.9%)、叶绿素b标准品(99.9%)、叶黄素标准品(99.9%)(美国CIL公司)。 1.2 实验方法 1.2.1 标准溶液的配制 标准储备溶液:利用百万分之一天平准确称取0.5 mg叶绿素a标准品、叶绿素b标准品、叶黄素标准品,分别用95%乙醇溶解,于25 mL容量瓶中定容,储存于-20 ℃冰箱,备用。 混合标准储备溶液:各取5 mL上述叶绿素a和叶绿素b的标准储备溶液混合,储存于-20 ℃冰箱,备用。 标准溶液的配制:用上述的混合叶绿素a和叶绿素b的标准储备溶液以及叶黄素分别逐级稀释,配制成浓度为0.05、0.5、2.0、10、50 mg/L的系列标准工作溶液。 1.2.2 植物样品的前处理 精密称取0.1 g的绿叶碎片以及绿叶根部各3份,分别加入1 mL 95%乙醇溶液,匀浆,匀浆后放置于冰箱中低温提取4 h,提取完毕后于4 ℃下高速离心20 min。低温离心后取上层绿色清液,过0.45 μm微孔滤膜后,置于2 mL液相小瓶中备用。 1.2.3 色谱条件 色谱柱:氰基柱(4.6 mm × 250 mm,粒径5 μm),流动相:V(甲醇(A)):V(纯水(B))=76:24;流速为1 mL/min,二极管阵列检测器(PDA)波长为663 nm(叶绿素a)、645 nm(叶绿素b)、445 nm(叶黄素);柱温箱温度40 ℃;进样量10 μL。 2 结果与讨论 2.1 色谱条件优化 2.1.1 流动相的选择 目前,反相高效液相色谱检测植物色素的流动相复杂且分离效果差,难以达到准确定量的目的。本研究旨在采用常规流动相水,甲醇,乙腈或其中的两种到3种混合溶剂对植物中的色素进行分析。由于植物色素叶绿素a、叶绿素b以及叶黄素极性较小(下图为3种色素的化学结构),所以采用有机溶剂作为洗脱剂。此外,叶绿素a和叶绿素b结构相似,乙腈洗脱能力较甲醇强,若用乙腈作为洗脱液,两种色素难以分离,导致影响色素的准确定量,因此选用甲醇作为洗脱剂。用甲醇和纯水作流动相,实验中不断改变流动相的比例:V(甲醇):V(水)为95:5、90:10、80:20、70:30。当流动相的V(甲醇):V(水)=70:30时,叶绿素a、叶绿素b和叶黄素的峰形较好,分离度符合要求,在20 min之内出峰。为了进一步缩短出峰时间,优化峰形,进一步优化洗脱流动相比例[17],使得3种植物色素的出峰时间控制在15 min以内,最终选用V(甲醇):V(水)=76:34为流动相进行绿色植物中叶绿素a、叶绿素b和叶黄素的分离。 被分析物的洗脱速率影响因素之一为流动相的流速[17],流速的不同影响着物质在色谱中的出峰时间,在不干扰分离效果的条件下,同时节约时间成本,应尽量提高流动相的流速。综合各种因素,流速以1.0 mL/min为适中。 检测波长的选定是紫外及荧光类的检测器的关键。本研究采用的紫外检测器是全程扫描、二极管阵列的三维检测器,经过多次的尝试,确定叶绿素a的激发波长为663 nm;叶绿素b的激发波长为645 nm;叶黄素的激发波长为445 nm。 声明:本文所用图片、文字来源《化学试剂》,版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题,请与本网联系删除。 相关链接:叶绿素,甲醇,叶黄素
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